Ora possiamo visualizzare set di dati bigWig generati nella sezione precedente in un browser genoma. C’è una varietà di browser disponibili. In questo tutorial useremo IGV Browser (questo video mostra come visualizzare più set di dati in IGV).

Raccolta di pezzi grossi prodotti da bamCoverage sopra. Si noti che in un set di dati espanso (Reb_R2) there is avisualizza il collegamento IGV`.

Facendo clic su questo collegamento in tutti e quattro i set di dati (è necessario espandere ciascun set di dati facendo clic su di esso. Questo esporrà IGV link) e concentrandosi browser su MPH1 (YIR002C) gene produrrà la seguente immagine:

Copertura distribuzione all’interno IGV. Qui le repliche di chip sono colorate in arancione e i controlli sono blu. Tutte e quattro le tracce sono state impostate sul valore massimo di 70.

Chiamare picchi

Mentre i picchi mostrati nello screenshot del browser sopra sono abbastanza chiari e coerenti tra le due repliche, guardando l’intero genoma nel browser non è certo un modo sostenibile per identificare tutti i picchi. Esistono diversi modi per identificare gli eventi di legame a livello genomico. Sono riassunti nella figura seguente:

Schema di tre metodi di rilevamento degli eventi di binding CHIP-seq. I metodi di ricerca del picco in genere spostano le posizioni dei tag CHIP-seq in una direzione 3′ della metà della lunghezza prevista del frammento o estendono la lunghezza del tag in una direzione 3′ per essere uguale alla lunghezza prevista del frammento. I tag dei trefoli opposti vengono uniti per costruire paesaggi di densità dei tag non marchiati e le posizioni degli eventi vincolanti sono previste dalle posizioni con la massima copertura dei tag all’interno di ciascuna regione che contiene un significativo arricchimento dei tag chip-seq (cioè il vertice del picco). Analisi dei metodi di accoppiamento di picco tra la mappatura delle letture a + e-trefoli. Diamo un’occhiata a questi risultati:

Replicate 1	Replicate 2
Peak model and lag between strands.

In the case of these data peaks are very sharp and have narrow gap between them: 27 and 33 bp for replicate 1 and 2, respectively. Useremo una media di questi valori, 30, come --extsize parametro per la chiamata di picchi di utilizzo di NGS: Picco di chiamata → MACS2 callpeak:

Chiamare con picchi MACS2 dati raccolti. Qui scegliamo più ingressi premendo il pulsante e selezionando entrambi i set di dati di chip nel file di trattamento ChIP-Seq e entrambi i set di dati di input DNA nel file di controllo ChIP-Seq. Selezioniamo quindiSaccharomyces cerevisiae genoma come dimensione effettiva del genoma. MACS2s interfaccia è lunga e abbiamo diviso in più pezzi in questa figura. Vedi anche la sezione inferiore – è importante!

In questa parte inferiore del MACS2 interfaccia, impostare la costruzione di un modello di Do not build the shifting model (abbiamo già fatto con preductd nel passaggio precedente) e *Impostare la dimensione dell’estensione 30 (il numero si stima che nel passaggio precedente). Infine, chiederemo solo MACS2 per produrre due uscite: Peak summits e quello che ha prodotto per impostazione predefinita, che contiene le coordinate di picco.

Se si impostano i parametri come è stato mostrato sopra MACS2 produrrà due uscite (se ne ha prodotte di più basta trovare quelle chiamate narrow peaks e summits). Facciamo clic sull’icona della matita () adiacente ai set di datisummits enarrow peak e rinominiamo quindi come mostrato di seguito:

MACS2 output with summits and narrow peak datasets renamed.	.

Next, we will run MACS2 on BAM datasets for Replicate 1 only:

Chiamare picchi conMACS2 su R1 Ad eccezione di selezionare solo set di dati R1, tutti gli altri parametri devono essere impostati come nella figura precedente.

Alla fine dovresti avere qualcosa del genere:

Tutti i MACS2 dataset. Dopo aver eseguitoMACS2 tre volte avremmo dovuto interrogare i set di dati R1 e R2.

Ispezione dei picchi

Cosa c’è nell’output?

Guardando i dati MACS2 abbiamo ottenuto i seguenti numeri di picchi:

Peaks data is generated in the following format:

 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10--------------------------------------------------------------------chrI 35 491 MACS2_peak_1 176 . 10.35332 21.51081 17.68957 101chrI 87135 87212 MACS2_peak_2 127 . 7.71763 15.89278 12.78060 26chrI 92612 92793 MACS2_peak_3 153 . 9.22373 18.72748 15.31966 49chrI 119739 119782 MACS2_peak_4 78 . 6.08885 10.52482 7.82302 25

where columns are:

1. Cromosoma
2. Start
3. Fine
4. Iterativo id offerto da MACS2
5. Integer punteggio per display
6. Strand (irrilevante in questo caso)
7. Fold-change (fold arricchimento per questo picco di vertice contro casuali con distribuzione di Poisson con locale lambda)
8. -log10P-valore (ad esempio, 17.68 1 x 10-17)
9. -log10Q-valore da Benjamini–Hochberg–Yekutieli procedura
10. Relativa vertice posizione a picco start

Come molte cime sono comuni tra repliche?

Per vedere quanti picchi sono comuni tra i set di dati in pool e le due repliche useremo Operate on Genomic Intervals → Join tool twice.

Prima di tutto ci uniremo Peaks pooled con Peaks R1:

Entrare in Pool e R1 risultati con Join strumento. Si noti che, poiché abbiamo rinominato i set di dati, ora sono facilmente selezionabili.

Successivamente uniremo il risultato dell’operazione precedente con Peaks R2:

Unire Pooled/R1 con i risultati R2 con Join strumento. Si noti che, poiché abbiamo rinominato i set di dati, ora sono facilmente selezionabili.

Questo si traduce in 723 regioni sono condivisi tra intervistati, R1, e picchi R2. Chiamiamo questo set di alta fiducia. Prima di poterlo utilizzare, tuttavia, tagliamo solo le colonne pertinenti. Poiché abbiamo prodotto questo set di dati unendo altri tre set di dati, è tre volte più ampio (30 colonne). Per tagliare queste prime tre colonne possiamo usare lo strumento Manipolazione testo → Taglia colonne:

Tagliare colonne da Join output.

Quindi dobbiamo assicurarci che l’output di Cut columns abbia il tipo BED. Per fare ciò modificheremo i metadati come mostrato di seguito:

Impostando i metadati sul tipo di dati BED. Fare clic sull’icona a forma di matita() adiacente al set di dati e scegliere la scheda Tipo di dati. Lì sarai in grado di impostarlo su BED.

vediamo tutto nel browser

visualizzare Unite sulle vette Stretti picchi e Vette prodotto da MACS2 in IGV cliccando su display with IGV local link adiacente al Peaks pooled e High confidence set dataset (si dovrebbe già avere il browser aperto):

Una panoramica IGV. Qui puoi vedere i set di dati originali bigWig insieme ai picchi previsti.

Quali motivi di sequenza si trovano all’interno dei picchi

In questo esperimento gli anticorpi contro la proteina Reb1 sono stati utilizzati per l’immunoprecipitaion. Il sito di riconoscimento per Reb1 è TTACCCG (Badis:2008 e Harbison:2004). Per scoprire quali motivi di sequenza si trovano all’interno dei nostri picchi, dobbiamo prima convertire le coordinate in sequenze sottostanti. Questo viene fatto usando Fetch Allineamenti / Sequenze → Estrai lo strumento DNA genomico:

Estraendo il DNA genomico corrispondente ai picchi di CHIP-seq. Qui usiamoMerged peaks dataset generato pochi passaggi prima.

Successivamente, dobbiamo assicurarci che tutte le sequenze siano sufficientemente lunghe per trovare modelli. MEME, gli strumenti che useremo per trovare motivi, sequenze necessarie per essere almeno 8 nucleotidi lunghi. Quindi rimuoveremo sequenze brevi usando FASTA manipulation → Filter sequences by length tool:

Filtering FASTA by length. Qui stiamo rimuovendo tutte le sequenze in corto di 8 nucleotidi.

Ora possiamo eseguire Motif Tools → MEME:

Esecuzione di MEME su sequenze FASTA filtrate in lunghezza dal passaggio precedente. Si noti che la configurazione delle opzioni è impostata su Advancede Check reverse complement è impostata su Yes.

MEME genera un numero di uscite. Il più interessante è il report HTML. Mostra che 620 regioni contengonoTTACCCG motif:

MEME Motif trovato in 620 sequenze corrispondenti alle regioni di picco comuni.

Riassumendo CHIP arricchimento del segnale in tutti i geni

Quanti geni contengono regioni a monte arricchiti in tag ChIP. Questo è spesso rappresentato come una heatmap:

Esempio di Heatmap dalla documentazione di DeepTools.

Per generare la heatmap dobbiamo prima produrre set di dati normalizzati per i due replicati che abbiamo. Questo viene fatto usando NGS: DeepTools → bamCompare tool:

In esecuzione bamCompare sulla replica 1. Qui impostiamo il metodo da utilizzare per ridimensionare il campione più grande al più piccolo a SES (anche se potresti voler provare anche altri metodi. SES è stato brevemente discusso sopra.

Poiché vogliamo tracciare l’arricchimento attorno ai geni, dobbiamo scaricare l’annotazione genica. Useremo Get Data → UCSC Main per questo:

Ottenere dati da UCSC. Qui assicurati di selezionare assembly chiamatosacCer3 e stai scegliendoSGD Genes. Facendo clic su Ottieni output verrà visualizzata la schermata successiva mostrata di seguito.

Qui basta fare clic su Invia query a Galaxy.

Successivamente, per preparare i dati necessari per disegnare la heatmap useremo NGS: DeepTools → computeMatrix utility:

Computing matrix – i dati da cui verrà costruita la heatmap. Qui entrambi i set di dati normalizzati sono selezionati all’interno della casella file Score, i geni di lievito che abbiamo appena scaricato da UCSC sono scelti come regioni da tracciare. “il punto di riferimento è impostato come opzione principale computeMatrix e, infine, le distanze a monte e a valle sono impostate su 2.000 bp. Ovviamente siete invitati a giocare con questi parametri.

Infine, possiamo visualizzare la heatmap usando NGS: DeepTools → plotHeatmap tool:

Disegnando heatmap conplotHeatmap tool.

L’immagine risultante mostra che una frazione significativa di 6,692 geni presenti nell’annotazione dei dati abbiamo utilizzato contenere Reb1 siti di legame all’interno delle loro regioni a monte:

Heatmap che mostra la distribuzione di Reb1 siti di legame tra regioni a monte di 6,692 lievito geni.

Non abbiamo falsificato questo

Questa intera analisi è disponibile come cronologia della galassia qui. Importarlo e giocare con esso.

E così va…

Speriamo che questo tutorial ti abbia dato il gusto per ciò che è possibile. Ci sono più strumenti là fuori così esperimento! Se le cose non funzionano – si lamentano utilizzando Open Chat pulsante qui sotto o il nostro forum di supporto.